文章信息

  • 题目：Atmospheric Methane Oxidizers Are Dominated by Upland Soil Cluster Alpha in 20 Forest Soils of China
  • 年份：2020
  • 单位：南京土壤所
  • DOI：10.1007/s00248-020-01570-1
  • 杂志：Microbial Ecology (IF 3.356)
  • 分类：Research article

评论

  • 提出了针对MOB的16S rRNA基因及pmoA基因注释方案

  • 评估了目前pmoA通用引物的扩增偏好性，提出半巢式PCR能改善这一问题

引言

  • 首个pmoA基因引物A189f/A682r是为扩增颗粒型甲烷单加氧酶(pMMO)及氨单加氧酶设计的，用这对引物检测到了USCα类群的RA14分支

  • pmoA特异的反向引物mb661r和A650与正向引物A189f广泛用于探究环境样品中的甲烷氧化菌(MOB)

  • 这些引物存在不同程度上的PCR偏好性，且与其它生物标记物如16S rRNA基因测序结果的一致性缺乏报道

材料和方法

样品采集

  • 对中国从西南地区到东北地区覆盖不同优势植被的森林土壤采样，共设置20个采样点

16S rRNA基因测序

  • 16S rRNA基因V4-V5区通用引物：515F/907R

  • 收集了179个近全长的MOB 16S rRNA基因序列及其相近物种的16S rRNA基因序列，补充RDP (version 16)数据库进行物种注释

  • 所有注释为Methylocystaceae, Beijerinckiaceae, Methylococcaceae, Methylothermaceae, Crenotrichaceae, Methylacidiphilaceae, Methylacidimicrobium, Chromatiales, Methyloceanibacter methanicus, Candidatus_Methylomirabilis的序列都提取出来作为潜在的MOB序列

pmoA基因测序

  • 采用四种PCR流程探究森林土壤中pmoA基因的组成：

    1. A189f/A682r
    2. A189f/mb661r
    3. A189f/A650
    4. 半巢式PCR

  • 半巢式PCR流程：

    1. 用A189f/A682r进行touch-down PCR第一轮扩增
    2. 第一轮扩增的产物作为模板，用A189f及mb661r和A650的混合物进行第二轮扩增

  • 分析使用mb661和A650引物的数据时，先用对应引物作为barcode将数据分成两部分

  • pmoA序列的分类注释见参考文献[1]

结果

基于不同引物对的MOB群落组成

  • 16S rRNA基因序列中MOB占0.12%-0.32%。从17个样品中检测到USCα，其中14个样品中USCα占所有MOB的一半以上；仅在两个样品中检测到USCγ

  • 用A189f/A682r只有3个样品获得了足量的PCR产物进行测序，大多数情况下，由于非特异扩增，PCR产物的大小与pmoA不匹配

  • 用A189f/mb661r和A189f/A650分别成功扩增19个和15个样品，仍然存在非特异性扩增及低扩增效率的问题

  • 半巢式PCR获得的PCR产物条带更亮，但非特异扩增的问题仍然难以避免

  • 用A189f/A682r获得的序列极少数注释为已知的MOB，绝大多数注释为USCα

  • 用A189f/mb661r获得的序列大部分注释为Methylocystis，USCα仅在4个样品中丰度超过50%；12个样品中检测到USCγ，但丰度基本都不足0.5%；Methylosarcina也经常检测到

  • 用A189f/A650扩增出的基本全是USCα，极度忽略Methylocystis及其它MOB

  • 半巢式PCR削弱了A189f/mb661r和A189f/A650单次扩增的偏好性，结果与16S rRNA基因测序比较一致，但个别样品差异也很大

  • 将半巢式PCR获得的序列按照mb661r和A650进行拆分，mb661r获得的序列数量更多，说明两个引物的扩增效率不同；mb661r的结果与两个引物混合的结果基本相同，说明mb661r对Methylocystis的偏好性在半巢式PCR中不明显；A650的偏好性在半巢式PCR中也有改善

OTU水平上pmoA基因引物偏好性比较

  • A189f/A650对JR1/Cluster5的扩增效率更高，对RA14的扩增效率较低

  • A189f/mb661r与A189f/A650类似，但对个别OTU的偏好性不一致

  • 半巢式PCR改善了A650和mb661r的偏好性，可能是由于第一轮PCR中使用A682r

环境因子与MOB群落的关系

  • 用半巢式PCR的数据集进行CCA分析

  • RA14与$TN$, $NO_3^−-N$, $NH_4^+-N$, $C/N$, 降雨量呈正相关，与pH, 温度, 海拔呈负相关

  • USCγ与pH和海拔呈正相关，与$NH_4^+-N$, $TN$, $C/N$, 降雨量呈负相关

  • 大多数JR1/Cluster5的OTU与温度和海拔呈正相关

参考文献

[1] Dumont M, Lüke C, Deng Y, Frenzel P. 2014. Classification of pmoA amplicon pyrosequences using BLAST and the lowest common ancestor method in MEGAN. Frontiers in Microbiology 5.